雙孢菇制種技術(shù)方法

一、孢子分離法　　蘑菇孢子分離法，是利用成熟子實(shí)體的有性擔(dān)孢子能自動(dòng)從子實(shí)體層中彈射出來(lái)的特征，在無(wú)菌條件下和適宜的培養(yǎng)基上，使孢子萌發(fā)成菌絲，獲得純種的一種方法。孢子分離可分為單孢分離和多孢分離法兩種，由于是從有性擔(dān)孢子（是指其細(xì)胞核已經(jīng)地核配過(guò)程）分離純菌絲體，因此生產(chǎn)上多采用多孢分離法來(lái)保持菌株的原有特性，而單孢分離法主要應(yīng)用于菌株的篩選和雜交育種等工作，孢子分離主要分為兩個(gè)步驟，首先是采集孢子，其次進(jìn)行單孢或多孢子分離�！　。ㄒ唬┎杉�孢子　　１、種菇的選擇　采集孢子首先要選好種菇即分離用的子實(shí)體。一般蘑菇種菇要求是第一潮菇，出菇較早，單生，個(gè)體健壯，特征典型的子實(shí)體，經(jīng)過(guò)仔細(xì)的觀(guān)察篩選后在菇床上做個(gè)記號(hào)，讓種菇充分生長(zhǎng)，直至即將破膜時(shí)將菇采摘進(jìn)行孢子彈射�！　。�、孢子彈射收集　種菇采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒約一分鐘，用鑷子取出后經(jīng)無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再用無(wú)菌濾紙把表面水吸干，或直接用75% 酒精棉球輕輕控拭菌蓋及菌柄進(jìn)行表面消毒。隨后用無(wú)菌刀切掉多余菌柄（約留下1.5-2cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入鋁線(xiàn)制作的支持物上，放入了先準(zhǔn)備好鋪有無(wú)菌濾紙條的平皿上，蓋上鐘罩（如圖　所示）。這套孢子收集裝置需事先進(jìn)行高壓滅菌消毒。把裝好子實(shí)體的孢子彈射收集器放在溫度為15-20℃的室內(nèi)，經(jīng)24-48小時(shí)左右， 可見(jiàn)到無(wú)菌濾紙上有褐色的蘑菇孢子印。在無(wú)菌操作下把收集到蘑菇孢子的濾紙條裝入無(wú)菌的空試管中，并在溫度下進(jìn)行真空干燥，之后放入冰箱可長(zhǎng)期保存?zhèn)溆��！　。ǘ�）孢子分離　　１、多孢分離法　即把多個(gè)孢接種在同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)共同生長(zhǎng)交錯(cuò)在一起，從而獲得純種的一種方法，由于多個(gè)孢子間的種性互補(bǔ)，基本上可以保持親本的穩(wěn)定性，此法比較簡(jiǎn)易，在過(guò)去的蘑菇制種中應(yīng)用較為普遍�！　。ǎ保┬泵鎰澗�(xiàn)法：按無(wú)菌操作規(guī)程，用無(wú)菌接種環(huán)從收到孢子的濾紙條上沾取少量孢子，在PDA試管斜面培養(yǎng)基上自下而上劃線(xiàn)，劃線(xiàn)時(shí)勿用力， 以免劃破培養(yǎng)基表面，接種完畢，抽出接種種灼燒試管口，塞上棉塞，放置24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待孢子萌發(fā)后（一般約15-20天），挑選萌發(fā)快，長(zhǎng)勢(shì)旺的菌落， 轉(zhuǎn)接于新試管培養(yǎng)基上再行培養(yǎng)�！　。ǎ玻┩坎挤蛛x法：按無(wú)菌操作方法，取一小塊具有孢子的濾紙條，放入裝有無(wú)菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液，然后用已滅菌的試管，吸取孢子懸浮液，滴1-2滴到PDA試管或培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動(dòng)試管使孢子懸浮液均勻分布于斜面上，或用玻璃涂布棒將平板上的懸浮液涂布均勻。孢子在培養(yǎng)基上經(jīng)24℃恒溫培養(yǎng)萌發(fā)后，挑選幾株發(fā)育勻稱(chēng)，生長(zhǎng)速度快的菌落，移接于另一試管斜面培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)即為母種�！　。�、單孢分離　就是將采集到的孢子群?jiǎn)蝹�(gè)分開(kāi)進(jìn)行培養(yǎng)，讓它單獨(dú)萌發(fā)成菌絲而獲得純種的方法，單孢子分離的方法，按分離的手段可分為以下三種�！　。ǎ保┫♂尫蛛x法：這是通過(guò)不斷稀釋孢子懸浮液，使孢子分散最終孢子濃度控制在300-500個(gè)孢子/毫升，吸取0.1毫升的孢子液注入平板均勻涂布，分散孢子各自萌發(fā)形成單孢菌落，其步驟如下：　�、僦苽錈o(wú)菌水試管：取10支試管，其中1支裝100毫升蒸餾水，其它9支裝9毫升蒸餾水，經(jīng)高壓滅菌即成無(wú)菌水�！　、谥奇咦討乙海喝∫恍�塊收集有孢子的濾紙條，浸入10毫升無(wú)菌水試管中， 搖振使孢子分散成懸液，用無(wú)菌1毫升移液管吸取1毫升孢子懸液于第2支試管中， 搖振使其分期，再?gòu)牡?支試管中吸取1毫升注入第3支試管中， 如此反復(fù)稀釋直到孢子濃度達(dá)到300-500個(gè)孢子/毫升，備用。　�、壑婆囵B(yǎng)基平板：配制PDA培養(yǎng)基，裝入三角瓶中進(jìn)行高壓滅菌， 準(zhǔn)備倒平板的培養(yǎng)皿也經(jīng)過(guò)高壓滅菌備用，待已滅菌的PDA冷卻至50-60℃時(shí)，在無(wú)菌操作下倒15-20 毫升PDA至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放平，晝使培養(yǎng)基表面光滑，厚度一致。　�、苕咦油坎迹涸跓o(wú)菌操作下，吸取0.1毫升的孢子懸浮液滴在平板培養(yǎng)基表面上，使用T氏棒把孢子均勻涂布在平板上，蓋上刺激菌絲培養(yǎng)皿，放置于24-25℃恒溫箱中培養(yǎng)�！　、萏暨x單孢子萌發(fā)菌落：一般孢子經(jīng)過(guò)５天的培養(yǎng)開(kāi)始萌發(fā)長(zhǎng)出菌絲，培養(yǎng)皿經(jīng)過(guò)顯微鏡的鏡檢確定孢子萌發(fā)的菌落是由單個(gè)孢子萌發(fā)成長(zhǎng)而成的，可使用打孔器進(jìn)行打孔把該菌落移接至新鮮的PDA斜面試管中繼續(xù)培養(yǎng)。 打孔器的外徑應(yīng)小于顯微鏡的視野范圍，而且打孔之前須檢查該菌落周?chē)�是否有孢子或其它菌落，晝使打孔不�?huì)觸及周邊的孢子或菌落，確保純種。　�。ǎ玻┟�細(xì)管法：孢子懸浮液經(jīng)過(guò)稀釋?zhuān)�使用毛�?xì)滴管把孢子懸浮液滴一小滴于皿蓋內(nèi)，晝使每一滴只含有一個(gè)孢子，從而達(dá)到單孢子分離，其方法如下：　�、冁咦討腋∫褐苽渫�稀釋分離法，孢子濃度控制在200-300個(gè)孢子/毫升�！　、诿�細(xì)滴管制備：取潔凈的玻璃管在酒精噴燈上先拉成外徑1毫米的細(xì)管， 稍冷卻后再加熱并迅速拉長(zhǎng)，使管尖內(nèi)徑約200微米，剪斷即成毛細(xì)滴管，在滴管后端塞棉花， 裝入消毒盒中后進(jìn)行滅菌備用�！　、埸c(diǎn)樣鏡檢：用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)稀釋的孢子懸浮液約0.1毫升(可滴30滴)，在無(wú)菌操作下，快速點(diǎn)于皿蓋內(nèi)壁的標(biāo)記圈中央，滴液應(yīng)小于低倍鏡的視野， 點(diǎn)樣后的培養(yǎng)皿仍蓋在有水瓊脂的皿底上，貼膠布固定后再用低倍銳檢查皿蓋內(nèi)壁的的液滴，確定是單孢者，即在皿蓋上標(biāo)上記號(hào)。　�、芘囵B(yǎng)基推貼及刺激培養(yǎng)：使用接種針取一小塊PDA培養(yǎng)基(約2×2毫米方塊) 推貼至標(biāo)記為單孢子的液滴，使液滴中的孢子能夠吸附到培養(yǎng)基邊緣。 將事先培養(yǎng)好蘑菇氣生菌絲的平板培養(yǎng)皿蓋取下，套在菌絲平板的底部，再把已分離并推貼好的培養(yǎng)基的皿蓋罩在套有菌絲平板的玻璃皿上，使兩個(gè)皿蓋對(duì)接，貼膠布封口(要留0.5厘米縫用作通氣)，這樣就形成一個(gè)刺激單孢子萌發(fā)的培養(yǎng)室，置培養(yǎng)箱中24 ℃下培養(yǎng)，待單孢子萌發(fā)，及時(shí)撕下膠布，用接種鏟挑取已萌發(fā)的單孢菌絲貼塊，移接到新鮮PDA斜面試管中，置24℃恒溫箱中培養(yǎng)，即可區(qū)得單孢純種。　�。ǎ常┢餍捣蛛x法：應(yīng)用顯微操作器，直接挑選單孢子，移至PDA 平板中進(jìn)行孢子刺激萌發(fā)培養(yǎng)，獲得單孢純種�！　、冁咦討腋∫褐苽洌和�稀釋分離法，孢子濃度控制在1000個(gè)/毫升；　�、谄桨逋坎迹簩⑾♂尯蟮逆咦討腋∫旱�0.1毫升于平板上，用無(wú)菌的T氏棒進(jìn)行均勻涂布，每個(gè)平板含孢子大約100個(gè)左右；　�、坨R檢分離：待涂布均勻的平板瓊脂表面水分干燥后即可于顯微鏡下觀(guān)察，當(dāng)在視野中心見(jiàn)到孢子，而視野周?chē)鸁o(wú)其它孢子時(shí)，可用顯微操作器操縱玻璃針把孢子從培養(yǎng)基表面挑取，隨后把孢子轉(zhuǎn)移至PDA平板的表面上，進(jìn)行孢子萌發(fā)培養(yǎng)，孢子萌發(fā)培養(yǎng)須使用蘑菇氣生菌絲刺激培養(yǎng)，才能提高萌發(fā)率，培養(yǎng)的具體操作方法與涂布分離法相同�！　。ǎ矗﹩捂咦泳�落接待：當(dāng)孢子經(jīng)過(guò)10天的刺激培養(yǎng)， 肉眼可見(jiàn)到菌絲生長(zhǎng)而成小菌落，應(yīng)及時(shí)用打孢子器把該菌落分離，每天都應(yīng)觀(guān)察孢子萌發(fā)情況， 如果不及時(shí)把菌落移接，該菌落會(huì)快速生長(zhǎng)而影響較遲萌發(fā)單孢子的分離�！　《�、組織分離法　　組織分離法是利用子實(shí)體組織來(lái)分離獲得純菌絲的方法。組織分離系一種無(wú)性繁殖法，雙親的染色體沒(méi)有經(jīng)過(guò)重組，因此組織分離基本上可保持親本的生物不特性，棒操作簡(jiǎn)便，取村廣泛，在過(guò)去傳統(tǒng)的穩(wěn)定菌株中常采用此方法進(jìn)行菌種的分離，退化不明顯，但是隨著蘑菇雜交菌種的應(yīng)用，由于雜種本身所具有的不穩(wěn)定，組織分離常造成菌株的退化，目前生產(chǎn)上很少采用，只是進(jìn)行野生菌株分離時(shí)，才比較常用。其方法如下：　�、偬暨x種菇：其標(biāo)準(zhǔn)與孢子收集要求相同；　�、诠襟w消毒：將子實(shí)體菌柄基部切除，置接種箱內(nèi)，用75%酒精對(duì)菇體表面進(jìn)行消毒；　　③組織分離：解剖刀經(jīng)火焰滅菌，在菇柄中部縱切一刀， 用手掰開(kāi)菌再用接種鏟在菇蓋與菇柄交界處切五個(gè)小方塊，隨后挑取一小塊組織，迅速移接到PDA斜面培養(yǎng)基上，置24℃下培養(yǎng)，待組織塊長(zhǎng)出菌絲無(wú)污染即為純種。（ 未知）

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