對蝦白斑綜合癥病毒檢測技術(shù)概述

對蝦白斑綜合癥病毒（White Spot Syndrome Virus，wssv）病是全世界范圍內(nèi)對養(yǎng)殖對蝦危害最大的病毒病。迄今為止，學(xué)者們對引起該病的病毒命名尚不統(tǒng)一，有白斑桿狀病毒（WhiteSpotBac-ulovirus，WSBV）、皮下及造血組織壞死病桿狀病毒（HepodermalandHematopoietieNecroisisBacu-lovirus，HHNBV）、日本對蝦桿狀病毒（Rod-shapednuclearVirusofPenacusJaponicus，RV-PJ）和系統(tǒng)外胚層和中胚層桿狀病毒（SystemicEc- todermal and Mesoderrnal Baculovirus，SEMBV）等。所有這些病毒均被認(rèn)為屬于桿狀病毒科的無包涵體桿狀病毒亞群。在第六次國際病毒分類會議 （ICTV）報(bào)告中取消了以上命名，具體命名待定，按照Lightener的意見將其暫時命名為白斑綜合癥病毒（wssv）。我國自1993年暴發(fā)此病以來，每年都發(fā)生對蝦大規(guī)模毀滅性死亡，幾乎所有養(yǎng)殖蝦類皆可被其感染。WSSV毒力較強(qiáng)，3～10天內(nèi)被浸染者的累積死亡率達(dá)100.0%。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）2000年將其列為“需要作報(bào)告的疾病之一”。鑒于WSSV尚未有有效的治療方法，快速準(zhǔn)確的病原分離檢測技術(shù)已成為研究的焦點(diǎn)之一。本文就對蝦白斑綜合癥病毒（wssv）的檢測技術(shù)作一綜述，以供。 1 直接觀察法 直接觀察法是根據(jù)養(yǎng)殖過程中對蝦急性和慢性死亡的情況，對照白斑綜合癥的典型癥狀作出判斷。如頭胸甲出現(xiàn)白斑、甲殼變軟易剝離等，這種方法主要是根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)判斷，且必須是對蝦感染病毒致死后才能發(fā)現(xiàn)。 2 組織化學(xué)法與電子顯微鏡技術(shù) 組織化學(xué)法是取對蝦的各種組織用適當(dāng)?shù)娜旧�技術(shù)在光鏡下進(jìn)行檢測。主要有H-E染色和T-E染色等。莫照蘭等（2000）曾用H-E染色感染 WSSV病毒的螯蝦的鰓和胃組織，在光鏡下觀察病變組織與對照組呈現(xiàn)差異顯著，組織結(jié)構(gòu)松散殘缺呈壞死狀態(tài)。黃傻等首創(chuàng)一種用于現(xiàn)場診斷的T-E染色方法，整個檢測過程只需要10分鐘左右，具有快捷、簡單、方便等優(yōu)點(diǎn)，但是，這種方法對操作技術(shù)要求高，而且由于對蝦可能終生帶毒而不發(fā)病，因此，即使檢測到病毒也不能確認(rèn)一定會發(fā)病。相對而言電子顯微鏡觀察更為準(zhǔn)確，可直接觀察到病毒的形態(tài)和大小。吳友呂等（1995）曾用電鏡在對蝦體內(nèi)檢測到WSSV。姜明等（1996）對中國對蝦在病害暴發(fā)期間病蝦肝胰臟、鰓、腎和腸組織進(jìn)行固定切片，在透射電鏡蝦觀察到桿狀病毒的3種存在形態(tài)。莫照蘭等（2002）對螯蝦人工感染W(wǎng)SSV病毒并取鰓和胃用固定液固定，制成超薄切片在電鏡下觀察到WSSV的病毒粒子。謝數(shù)濤等（2000）純化WSSV病毒并負(fù)染后在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)病毒的精細(xì)結(jié)構(gòu)。Nunan等（1998）和Zhan等（1998）也曾對對蝦人工感染W(wǎng)SSV進(jìn)行了電子顯微鏡觀察。組織化學(xué)與電子顯微鏡技術(shù)都是在病毒大量增殖后才能觀察到，當(dāng)感染早期或處于潛伏期病毒量小時，則難以觀察到。 3 免疫學(xué)檢測技術(shù) 免疫學(xué)檢測技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)建立的，方法多種多樣，主要用于快速鑒定。單克隆抗體和多克隆抗體的制備是進(jìn)行檢測的必需工作。單克隆抗體技術(shù)是隨著雜交瘤細(xì)胞建立而發(fā)展起來的，可以產(chǎn)生對特異決定簇的特異抗體。優(yōu)點(diǎn)是制備抗體時抗原不需高度純化、特異性強(qiáng)；缺點(diǎn)是制備繁瑣、試驗(yàn)條件嚴(yán)格、易漏檢。多克隆抗體來源于抗血清，含所有抗原決定簇的抗體，易發(fā)生交叉反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性，特異性不強(qiáng)，一般不用于對蝦病毒的檢測。 對蝦病毒的檢測一般采用單克隆抗體，常用酶聯(lián)免疫吸附分析（EIJSA）實(shí)驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附分析是目前發(fā)展最快的免疫標(biāo)記技術(shù)，具有靈敏、快速、易操作、可定量等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用廣泛。于佳等（1995）將 WSSV病毒注射小鼠，用免疫后的脾細(xì)胞與Sp2/O骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出了可用于WSSV檢測的單克隆抗體。黃倢等（1995）用單克隆ELISA技術(shù)提前20～40天對對蝦發(fā)病的可能性做出預(yù)報(bào)。涂小林等（1995）用純化的對蝦病毒免疫新西蘭兔獲得多克隆抗體，建立了病毒的間接ELlSA檢測技術(shù)，可在6小時內(nèi)完成對樣品的檢測，靈敏度可達(dá)60ng水平。史成銀等（1999）認(rèn)為以脫脂奶粉作封閉劑的快速間接ELISA方法具有大大縮短檢測時間，提高檢測靈敏度降低或消除酶標(biāo)板“邊緣效應(yīng)”、降低檢測成本等優(yōu)點(diǎn)，在對蝦病毒檢測的實(shí)驗(yàn)室研究和生產(chǎn)實(shí)踐上都具有廣泛的應(yīng)用前景。汪岷等（2000）用純化的WSSV免疫新西蘭兔獲得純化的IgG多克隆抗體，建立了雙抗體夾心法直接ELISA檢測方法，6小時左右即可完成檢測。朱建中等（2002）建立了WSSV單抗介導(dǎo)間接ELISA，不僅能快速檢測病毒，還可用于檢測WSSV在對蝦動物模型體內(nèi)的動態(tài)分布，為研究WSSV在螯蝦體內(nèi)的感染機(jī)理提供了手段。高宏等（2002）利用病毒細(xì)胞與宿主細(xì)胞親和吸附這一特性建立了新的篩選中和抗體的方法，可在缺少細(xì)胞系的情況下成功篩選中和抗體。 Ponlos等（1994）制備了對蝦WSSV病毒的 IgM型單克隆抗體，檢測新鮮對蝦時存在非特異性反應(yīng)，需將新鮮樣品凍存較長一段時間才能消除非特異性反應(yīng)。Lightner等（1998）用WSSV單克隆抗體進(jìn)行ELISA檢測對蝦時也出現(xiàn)上述問題。Hameed等（1998）用硝化纖維素酶免疫印跡法（NC-EIB）檢測WSSV感染斑節(jié)對蝦，發(fā)現(xiàn)在對蝦淋巴、眼柄、鰓、頭部軟組織、腹肌和肝胰臟都存在WSSV。Zhan等（1999）制備了WSSV的單克隆抗體在中國對蝦體內(nèi)檢測到了WSSV。 4 分子生物學(xué)技術(shù) 4.1 核酸探針（DNAProbe）技術(shù) 核酸探針技術(shù)又名基因探針或核酸分子雜交技術(shù)，其原理是兩條不同來源的核酸鏈如果具有互補(bǔ)的堿基序列就能夠特異結(jié)合成為分子雜交鏈。因此，在已知的DNA片段上加上可識別的標(biāo)記，成為探針來檢測未知樣品中是否具有與已知序列相同的序列，并判斷其與已知序列的同源程度。核酸探針具有敏感性高（可測出10E-9～10E-12的核酸）、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，易成功地用于多種疾病的診斷。在對蝦 WSSV病毒的檢測上，張巖等（1995）用Pub18構(gòu)建了對蝦WSSV的DNA重組質(zhì)粒，提取后經(jīng)斑點(diǎn)雜交和酶切分析，證明質(zhì)粒中插入的片段為病毒DNA。劉萍等（1995）從純化的病毒中提取DNA，用限制性內(nèi)切酶酶切并組裝到Puc18質(zhì)粒上，建立了WSSVDNA文庫，從中篩選出3個重組質(zhì)粒，用光敏生物標(biāo)記成探針檢測染毒對蝦效果很好。石正麗等（1998）從中國對蝦病蝦中分離到一種桿狀病毒，在重組質(zhì)粒中取2個克隆與WSSV基因片段制成探針檢測我國沿海地區(qū)中國對蝦桿狀病毒的同源性。鄧敏等（2000）通過分離純化WSSV部分基因組文庫，將制備的探針進(jìn)行Southern雜交、打點(diǎn)雜交和原位雜交，結(jié)果證明克隆片段對WSSV特異，可用于WSSV檢測。常青山等（2000）從中國對蝦桿狀病毒核酸隨機(jī)文庫中篩選出4個片段用地高辛標(biāo)記作為探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交檢測對蝦桿狀病毒，實(shí)驗(yàn)表明中國對蝦桿狀病毒存在垂直傳播的可能性。Lo等在檢測野生斑節(jié)對蝦WSSV時也發(fā)現(xiàn)該病毒存在垂直傳播的可能性。黃燦華等（2000）首先用地高辛標(biāo)記的WSSV核酸探針動態(tài)研究其在對蝦體內(nèi)的侵染過程，對蝦攝取感染W(wǎng)SSV的食物，經(jīng)消化道上皮細(xì)胞進(jìn)入蝦體，伴隨淋巴循環(huán)進(jìn)而侵染其它靶組織，直至對蝦發(fā)病死亡。呂玲等（2000）用WSSV核酸探針原位雜交（1SH）檢測對蝦，發(fā)現(xiàn)對蝦的不同組織對病毒具有特異性，并比較了ISH與H-E兩種檢測方法，結(jié)果ISH比H-E染色更準(zhǔn)確、敏感。朱建中等（2001）用核酸探針斑點(diǎn)雜交方法研究了WSSV青島株在螯蝦體內(nèi)的動態(tài)分布，表明病毒在對蝦和螯蝦體內(nèi)感染機(jī)理具有相似性。Lo等（1999）、Chang等用此技術(shù)檢測WSSV，但不是用PCR擴(kuò)增基因片段得到核酸探針的。Nunan等和徐洪濤等以從感染對蝦中純化的WSSV為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用DIG標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物而得到探針。 雷質(zhì)文等（2001）用PCR成功制備了DIG標(biāo)記探針，用于檢測對蝦WSSV，證實(shí)了白對蝦時WSSV的天然宿主。該法比常規(guī)方法快速，特異性、敏感性和可重復(fù)性均較高，可作為對蝦暴發(fā)病的診斷、抗特定病原對蝦的選育、出入境對蝦及對蝦產(chǎn)品的檢疫方法，目前已制備成試劑盒。宋曉玲等（2001）用DNA斑點(diǎn)雜交檢測對蝦及其飼料和環(huán)境生物，發(fā)現(xiàn)對蝦主要餌料及環(huán)境生物類群均可檢出WSSV，為了解對蝦WSSV的感染途徑提供了依據(jù)。莫照蘭等（2002）用地高辛標(biāo)記的核酸探針檢測WSSV人工感染的淡水克氏原螯蝦，結(jié)果表明對蝦WSSV克感染淡水克氏原螯蝦，病毒核酸原位雜交檢測敏感特異。 4.2 PCR技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種可在體內(nèi)將特異性DNA序列進(jìn)行高效擴(kuò)增的技術(shù)，與傳統(tǒng)診斷方法相比，它具有敏感性及特異性高，簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于 WSSV的檢測。汪岷等（1998）用臺灣WSSV的引物，對中國對蝦桿狀病毒進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明中國對蝦桿狀病毒與臺灣WSSV的同源性達(dá)98.7%，該P(yáng)CR引物可用于對蝦桿狀病毒的檢測。劉萍等（1999）采用PCR檢測方法對人工感染親蝦的胃、鰓、卵巢、卵和各期幼體進(jìn)行跟蹤檢測，認(rèn)為WSSV難以從卵直接向幼體進(jìn)行傳播。戰(zhàn)文斌等 （2000）通過PCR技術(shù)檢測中國對蝦WSSV，認(rèn)為存在由親蝦傳播給蝦苗的感染途徑。 （2000）應(yīng)用PCR技術(shù)分別對暴發(fā)性流行病發(fā)生前、中、后期的對蝦樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明PCR可快速靈敏準(zhǔn)確的檢測WSSV、對病毒的早期診斷和健康對蝦的選育提供依據(jù)。謝數(shù)濤等（2000）通過對WSSV基因測序設(shè)計(jì)PCR引物，建立了對蝦WSSV的PCR檢測方法。上海生化所已研制成中國對蝦桿狀病毒 PCR診斷試劑盒，靈敏度達(dá)0.125ng，在上海、浙江等地應(yīng)用時具有特異性。 為使檢測結(jié)果更快速更準(zhǔn)確，一些學(xué)者對PCR技術(shù)做了不同改進(jìn)。呂玲等（2000）用改進(jìn)的煮沸法提取WSSV病毒DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，節(jié)省了檢測時間（僅需4小時）且敏感性更高特異性更強(qiáng)，并認(rèn)為附肢和肌肉是PCR檢測的合適部位。章曉波等（2000）將對蝦WSSV的一段特異性DNA設(shè)計(jì)成分子信標(biāo)探針，用于該病毒的PCR檢測，結(jié)果顯示分子信標(biāo)不影響PCR擴(kuò)增且具有較高的特異性。夏春等（2000）根據(jù)對蝦WSSV基因序列設(shè)計(jì)了4個多重PCR法用引物，建立了多重PCR檢測WSSV的方法，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，可從陽性感染的中國對蝦fg級DNA中定性檢測WSSV。謝數(shù)濤等（2001）利用套式PCR檢測對蝦WSSV，結(jié)果顯示其靈敏度大約為一步PCR的10E4倍。龐耀珊等（2003）設(shè)計(jì)了一對WSSV的特異性引物，建立了快速檢測WSSV的二溫式PCR，最低可檢測到1.0pg的WSSV總DNA，該P(yáng)CR具有高度特異性和敏感性，可用于WSSV感染初期或潛伏期的親蝦和蝦苗的檢測和環(huán)境監(jiān)測。 綜上所述，對蝦WSSV的檢測技術(shù)從最初依靠組織病理學(xué)和透射電鏡觀察到免疫學(xué)方法、DNA雜交和PCR技術(shù)，靈敏度、特異性和重復(fù)性都有了很大提高，檢測結(jié)果更加快速準(zhǔn)確。一般PCR比DNA雜交，熒光標(biāo)記比酶聯(lián)免疫標(biāo)記靈敏，由于條件限制，PCR常用于實(shí)驗(yàn)室操作，熒光免疫需特殊儀器，因此DNA雜交和酶聯(lián)免疫應(yīng)用較多。為了提高檢測的靈敏度，彌補(bǔ)單一檢測方法的不足，可采用多種方法結(jié)合使用。如制備DNA探針時，利用PCR擴(kuò)增使探針量增加，DNA雜交與ELISA結(jié)合使用，再用酶標(biāo)記探針的方法，PCR技術(shù)與DNA雜交結(jié)合使用，用DNA雜交檢測PCR產(chǎn)生的結(jié)果，熒光標(biāo)記用于PCR產(chǎn)物的檢測，使結(jié)果更直觀。總之，隨著檢測方法的不斷改進(jìn)，對蝦WSSV的檢測將更快速、簡便、靈敏、特異。（ 佚名）

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